Abstract: Há mais de 50 anos os geradores de 68Ge/68Ga vêm sendo desenvolvidos, obtendo o 68Ga sem a necessidade da instalação de um cíclotron próximo à radiofarmácia ou ao centro hospitalar que tenha um PET/CT. O 68Ga é um emissor de pósitron com baixa emissão de fóton (β+, 89%, 1077 keV) e meia vida de 67,7 minutos, compatível com a farmacocinética de moléculas de baixo peso molecular, como peptídeos e fragmentos de anticorpos. Além disso, a química do Ga permite a ligação estável com agentes quelantes acoplados com peptídeos, como o DOTA. Todas estas características do 68Ga aliado a tecnologia PET/CT permitiram avanços em imagem molecular, como no diagnóstico de doenças de origem neuroendócrina. Entretanto, o eluato de 68Ga proveniente dos geradores de 68Ge/68Ga comerciais, ainda contém altos níveis de contaminantes, como o 68Ge e outros metais que competem quimicamente com o 68Ga, como o Fe3+ e Zn2+ e, como consequência, há redução do rendimento de marcação com biomoléculas. Quanto menor a quantidade de impurezas no eluato, a competição entre o peptídeo radiomarcado e peptídeo não marcado será menor e a qualidade de imagem será melhor, por isso existe a necessidade de diminuir a quantidade destes metais. Portanto, os objetivos deste trabalho são avaliar os métodos de purificação do 68Ga para a marcação de biomoléculas, com ênfase no estudo das impurezas químicas presentes nos radioisótopos primários, e desenvolver um método de purificação inédito. Diversos métodos de purificação foram estudados. Na purificação em resina catiônica tradicional e comercial, em que o 68Ga é adsorvido em resina catiônica e eluído em uma solução de acetona/ácido, a resina utilizada não é disponível comercialmente. Várias resinas catiônicas foram testadas simulando o processo comercial, e o uso das menores partículas da resina catiônica AG50W-X4 (200-400 mesh) foi a que apresentou os melhores resultados. Um método inovador foi a cromatografia por extração, onde o éter diisopropílico é adsorvido em resina XAD 16 e o 68Ga eluído em água deionizada. Apesar dos resultados de recuperação do 68Ga e a separação entre o 68Ga e o 65Zn terem sido bons, não houve reprodutibilidade na purificação dos metais. O método mais promissor e inédito foi a purificação do 68Ga em resina catiônica em meio básico que apresentou bons resultados, principalmente em relação à redução do Zn (98 ± 2)%, o contaminante químico encontrado em maior abundância no eluato de 68Ga. A redução total de impurezas foi (95 ± 4)%. Os peptídeos DOTATOC/DOTATATO foram marcados com o 68Ga em três diferentes formas: purificado em meio básico, por extração por solventes e sem a purificação prévia, o melhor resultado de rendimento de marcação do 68Ga DOTATATO foi obtido após a purificação do 68Ga em meio básico, comprovando a eficiência do processo.

Palavras-Chave: purification; decontamination; gallium 67; gallium 68; resins; chromatography; radioisotope generators; isotope applications; labelling; radiopharmaceuticals; biological repair

Abstract: Uma grande variedade de moléculas já foi identificada por apresentar alta afinidade por receptores superexpressos em células tumorais, e a radiomarcação dessas moléculas oferece a possibilidade de novos compostos com aplicações diagnósticas e terapêuticas em medicina nuclear. Dentre essas moléculas, a bombesina (BBN) é uma das que despertam maior interesse, uma vez que um de seus receptores BB2 são superexpressos em células de tumores de próstata, mama, cólon, pâncreas e pulmão, além de glioblastomas e neuroblastomas. Derivados da bombesina, agonistas e antagonistas dos receptores BB2 já foram propostos para essa finalidade e apresentaram resultados promissores em estudos pré-clínicos. Entretanto, a maioria deles apresenta o incoveniente da alta captação em tecidos sadios, como pâncreas e intestino, o que pode prejudicar a eficiência diagnóstica e causar efeitos adversos na terapia. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar a marcação de uma nova série de derivados da bombesina com índio-111 (111In) e gálio-68 (68Ga), de modo a avaliar seu potencial para diagnóstico de tumores que superexpressam BB2 por tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT) ou por emissão de pósitrons (PET). Os peptídeos estudados apresentam estrutura genérica YGn-BBN(6-14)-Q, em que Q é o grupamento quelante, n é o número de aminoácidos glicina do espaçador YGn e BBN(6-14) é a sequência original de aminoácidos da BBN do aminoácido 6 ao 14. Estudou-se também o derivado em que a metionina (Met) terminal da sequência da bombesina foi substituída pela norleucina (Nle). A avaliação experimental dos derivados da bombesina foi dividida em quatro etapas: estudos computacionais, marcadores moleculares para SPECT, marcadores moleculares para PET e estudos toxicológicos. Os estudos computacionais consistiram na determinação dos coeficientes de partição (log P) e distribuição (log D) teóricos dos derivados da bombesina conjugados ao quelante DTPA (ácido dietileno-triamino-pentacético e DOTA (1,4,7,10-tetraazaciclododecano-tetracético). No desenvolvimento de marcadores moleculares para SPECT os derivados da bombesina de diferentes espaçadores conjugados ao DTPA e radiomarcados com 111In foram avaliados para determinação do melhor espaçador para aplicação in vivo, considerando não apenas as propriedades in vivo, mas também a estabilidade. Uma vez definido o espaçador, o derivado escolhido conjugado ao quelante DTPA ou DOTA foi submetido a estudos comparativos in vitro e in vivo utilizando linhagens tumorais que expressam os receptores BB2 em níveis variados, de modo a determinar o agente quelante mais adequado para aplicação in vivo. Nessa fase experimental, alguns estudos foram realizados também com um derivado da BBN BZH3, amplamente descrito pela literatura. No desenvolvimento de marcadores moleculares para PET, o derivado composto pelo espaçador e quelante escolhido foi radiomarcado com 68Ga e submetido a estudos de biodistribuição in vivo. Por fim, estudos toxicológicos em ratos foram realizados por meio da administração de um excesso dos derivados da BBN, a fim de avaliar a segurança para futura aplicação em estudos clínicos. Todos os derivados conjugados ao DTPA foram radiomarcados com 111In com alta pureza radioquímica e alta atividade específica (174 GBq/μmol). Os marcadores moleculares obtidos apresentaram alta estabilidade frente à reação de marcação e baixa estabilidade à temperatura ambiente, a qual foi aumentada com a adição de agentes estabilizantes. A análise em soro humano indicou degradação tempo-dependente dos marcadores moleculares pelas enzimas do soro e aumento da estabilidade com o acréscimo de aminoácidos glicina no espaçador, bem como pela substituição da Met terminal pela Nle. Os estudos em CLAE e de log P confirmaram os resultados de log P teórico e indicaram que os marcadores moleculares apresentam baixa lipofilicidade, a qual decresce com o aumento do espaçador e aumenta com a substituição do aminoácido terminal. Os estudos in vivo demonstraram que os marcadores moleculares de DTPA-111In apresentam rápido clareamento sanguíneo, excreção primariamente renal e baixo acúmulo abdominal. O marcador molecular que apresentou maior captação tumoral foi aquele com a Nle terminal (YG5N), e esse foi submetido à análise comparativa entre os quelantes bifuncionais DTPA e DOTA. O YG5N-DOTA foi radiomarcado com 111In com alta atividade específica (100 GBq/μmol). Ensaios de saturação em células de tumor de próstata (PC-3 e LNCaP) e mama (T-47D) in vitro demonstraram afinidade semelhante para o peptídeo conjugado a ambos quelantes, mas o YG5N-DOTA-111In se ligou mais às células de tumor de próstata, mas não às células de tumor de mama. Esse marcador molecular também foi mais internalizado pelas células PC-3. Os estudos in vivo indicaram maior estabilidade do marcador molecular conjugado ao DOTA em soro de camundongo, mas captação dos dois peptídeos semelhante pelo tumor de células PC-3 e LNCaP, embora esse último tenha demonstrado uma concentração duas vezes menor do receptor BB2. A imagem SPECT/CT dos tumores foi possível com os dois peptídeos. Em comparação com o derivado BZH3-111In, os marcadores moleculares apresentaram captação tumoral semelhante, mas as imagens foram mais favoráveis devido à menor captação abdominal. O YG5N-DOTA foi então radiomarcado com 68Ga, obtendo-se alta pureza radioquímica, e seu perfil de distribuição foi semelhante ao do derivado radiomarcado com 111In, com significativa captação pelo tumor de células PC-3. Os ensaios de tolerância toxicológica demonstraram que os derivados da bombesina são seguros até a concentração administrada, não apresentando toxicidade hematológica, hepática ou renal. O derivado da BBN YG5N conjugado ao DTPA ou DOTA é uma ferramenta promissora e segura para o diagnóstico de tumores que superexpressam os receptores BB2 por SPECT e PET.

Palavras-Chave: tumor cells; neoplasms; prostate; diagnosis; amino acids; bioassay; gallium 68; mice; positron computed tomography; photon emission; computerized tomography