ALMEIDA, B.E.; OLIVEIRA, J.E.; CARVALHO, C.M.; DALMORA, S.L.; BARTOLINI, P.; RIBELA, M.T.C.P.. Analysis of human luteinizing hormone and human chorionic gonadotropin preparations of different origins by reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 53, p. 90-97, 2010.
DAMIANI, RENATA; ALMEIDA, BEATRIZ E.; OLIVEIRA, JOAO E.; BARTOLINI, PAOLO; RIBELA, MARIA T.C.P.. Enhancement of human thyrotropin synthesis by sodium butyrate addition to serum-free CHO cell culture. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 171, p. 1658-1672, 2013.
ALMEIDA, B.E.; OLIVEIRA, J.E.; DAMIANI, R.; DALMORA, S.L.; BARTOLINI, P.; RIBELA, M.T.C.P.. Qualitative and quantitative reversed-phase high performance liquid chromatographic analysis of glycoprotein hormones in the presence of a large excess of human serum albumin. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, v. 63, p. 160-164, 2012.
DAMIANI, RENATA. Influência do butirato de sódio, da cicloheximida e do cloreto de manganês na produtividade, glicosilação e propriedades biológicas da tireotrofina humana derivada de CHO / Influence of sodium butyrate, cycloheximide and manganese chloride on productivity, glycisylation and biological properties of human thyrotropin CHO-derived. 2013. Tese (Doutoramento) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. 124 p.Orientador: Maria Teresa de Carvalho Pinto Ribela.
DOI:
10.11606/T.85.2014.tde-26022014-111813
Abstract: A influência do butirato de sódio (NaBu), do cloreto de manganês (MnCl2), combinados ou isolados, e da cicloheximida (CHX) na síntese de tireotrofina humana recombinante (r-hTSH) derivada de células CHO foi investigada pela primeira vez. Com exceção da CHX, que gerou uma redução de 1,5 vezes na produtividade volumétrica, todos os reagentes geraram um aumento (1,4 vezes para o MnCl2 e 3 vezes para o NaBu e NaBu+MnCl2) na produtividade volumétrica. Também foi observada uma diminuição no número de células viáveis com a utilização de todos os reagentes. A adição destes reagentes ao meio de cultura de células CHO produtoras de hTSH gerou também alterações na glicosilação do r-hTSH. As alterações geradas pela presença de CHX foram todas negativas, resultando em uma diminuição de 5,5% no conteúdo de ácido siálico, 10% na ocupação dos sítios de glicosilação, além de uma diminuição no conteúdo de todos os monossacarídeos neutros. Os demais reagentes, por outro lado, resultaram em alterações positivas. A presença de NaBu no meio de cultura acarretou um aumento de 12% no conteúdo de ácido siálico e de 3% na ocupação dos sítios de glicosilação. Com relação às estruturas de carboidratos presentes no hTSH, foi observado um aumento de 14% nas estruturas bi-antenárias, aumento no conteúdo de manose e fucose e uma diminuição no conteúdo de galactose e N-acetilglucosamina. A presença de MnCl2 no meio de cultura resultou em um aumento de 1,7% no conteúdo de ácido siálico e de 1,3% na ocupação dos sítios de glicosilação. Houve ainda um aumento no conteúdo de manose e N-acetilglucosamina e uma diminuição no conteúdo de fucose e galactose. Um aumento de 7% na freqüência de estruturas bi-antenárias foi também observado quando MnCl2 foi utilizado. O uso simultâneo de NaBu e MnCl2 proporcionou um aumento de 14% no conteúdo de ácido siálico e de 3% na ocupação dos sítios de glicosilação, bem como um aumento no conteúdo de todos os monossacarídeos neutros. Não houve, entretanto, alterações na freqüência das estruturas de carboidratos. Apesar de todas as alterações causadas pelos diferentes reagentes, não foram observadas diferenças na atividade biológica ou no comportamento farmacocinético das diferentes preparações de hTSH estudadas. Este estudo é extremamente relevante, tanto do ponto de vista do desenvolvimento de novos biofármacos, quanto do ponto de vista do controle de qualidade das glicoproteínas hormonais já utilizadas na clínica médica.
LOUREIRO, RENAN F.; OLIVEIRA, JOAO E. de; TORJESEN, PETER A.; BARTOLINI, PAOLO; RIBELA, MARIA T.C.P.. Analysis of intact human follicle-stimulating hormone preparations by reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography, A, v. 1136, p. 10-18, 2006.
QUEIROZ, J.C.F.; TEIXEIRA, C.F.P.; LEBRUN, I.; SPENCER, P.J.; ZUCCHI, T.M.A.D.. A glycoprotein with anti-inflammatory properties secreted by an Aspergillus nidulans modified strain. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases, v. 13, n. 2,
p. 527-543, 2007.
CAPONE, MARCOS V.N.; SUZUKI, MIRIAM F.; OLIVEIRA, JOAO E.; DAMIANI, RENATA; SOARES, CARLOS R.J.; BARTOLINI, PAOLO. N-glycoprofiling analysis in a single glycoprotein model: a comparison between recombinant and pituitary glycosylated human prolactin. Journal of Biotechnology, v. 202, p. 78-87, 2015.
BARTOLINI, PAOLO; RIBELA, MARIA T.C.P.; DAMIANI, RENATA; SILVA, FELIPE D.; LIMA, ELIANA R.; OLIVEIRA, JOAO E.; PERONI, CIBELE N.; TORJESEN, PETER A.; SOARES, CARLOS R.. Carbohydrate composition and site-occupancy determination in pituitary and recombinant preparations of human thyrotropin. Journal of Biotechnology, v. 256, suppl.,
p. S15-S15, 2017.
DOI:
10.1016/j.jbiotec.2017.06.053
Abstract: Human thyrotropin (hTSH) is a glycoprotein with three potential
glycosylation sites: two in the -subunit and one in the
-subunit. Carbohydrate site-occupancy is frequently neglected in
glycoprotein characterization, even if related to folding, trafficking,
initiation of inflammation, host defence and congenital disorders
of glycosylation (CDG). For the first-time N-glycoprofiling analysis
was applied to site-occupancy determination of two native pituitary
hTSH, in comparison with three CHO-derived preparations
of hTSH, a widely used biopharmaceutical. A single methodology
provided: (i) average N-glycan mass; (ii) mass fraction of
each monosaccharide and of sulfate; (iii) percent carbohydrate.
The results indicate that occupancy (65–87%) and carbohydrate
mass (12–19%) can be 34–57% higher in recombinant hormones.
The average glycan mass is 24% lower in pituitary hTSH and contains
∼3-fold fewer moles of galactose (P < 0.005) and sialic acid
(P < 0.01). The number of moles of fucose per mole of hTSH was
found 2.5-fold higher in the pituitary preparations. One of these
native preparations, presenting the smallest glycan mass, lowest
occupancy, GalNAc, sulfate, Gal and sialic acid contents, also presented
the lowest in vivo bioactivity and circulatory half-life. This
methodology, extremely important for comparing a recombinant
biopharmaceutical to its native equivalent, can be applied to any
physiologically or clinical relevant glycoprotein.
SANTANA, PATRICIA M.. Expressão de tireotrofina humana em células de embrião de rim humano (HEK293) / Human tryrotropin expression in human embrionic kidney cells (HEK293). 2016. Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. 64 p.Orientador: Maria Teresa de Carvalho Pinto Ribela.
DOI:
10.11606/D.85.2016.tde-05122016-160030
Abstract: Neste trabalho foi transfectada uma linhagem de células embrionárias de rim humano (HEK293) com os genes das subunidades α e β da tireotrofina humana (hTSH), hormônio glicoproteico secretado pela hipófise. Após 5 dias de cultivo obteve-se uma concentração de hTSH no meio condicionado de 0,95μg/mL. O material foi concentrado e purificado utilizando uma estratégia envolvendo duas etapas, uma cromatografia de troca catiônica e uma cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa, que permitiu uma recuperação de 55% e uma pureza >90%. O produto purificado (hTSH-HEK) foi analisado e comparado a uma preparação comercial obtida em células CHO (hTSH-CHO) e a uma preparação hipofisária (hTSH-Pit). A identidade e a pureza do hTSH-HEK foram avaliadas por métodos físicoquímicos e imunológico (espectrometria de massa MALDI-TOF, HPLC de exclusão molecular e de fase reversa, SDS-PAGE e ensaio imunoradiométrico). A porção glicídica do hTSH-HEK foi avaliada pela análise do perfil dos N-glicanos e o comportamento biológico deste hormônio foi avaliado por bioensaio in vivo e estudo farmacocinético. As 3 preparações apresentaram pureza equivalente (97%) e a massa molecular relativa do hTSH-HEK foi 2,1% menor do que a do hTSH-CHO e 2,7% maior do que a do hTSH-Pit. A maior hidrofobicidade relativa, avaliada por RP-HPLC, foi a do hTSH-HEK. Os N-glicanos identificados no hTSH-HEK foram do tipo complexo, apresentando predominantemente estruturas tri-antenárias, enquanto no hTSH-CHO e no hTSH-Pit as estruturas bi-antenárias foram predominantes. Foram detectadas diferenças significativas relacionadas à composição dos carboidratos para estas preparações, um teor muito menor de ácido siálico e muito maior de fucose foram observados no hTSHHEK. Foi confirmada a atividade biológica das 3 preparações, sendo a bioatividade do hTSHHEK 39% e 16% inferior à do hTSH-CHO e hTSH-Pit, respectivamente. A meia-vida circulatória do hTSH-HEK foi menor (1,5 X) que a do hTSH-CHO e a do hTSH-Pit (1,2 X). De acordo com esses resultados o hTSH-HEK pode ser considerado uma alternativa viável para aplicações clínicas especialmente por sua origem humana e composição de carboidratos.
SEVILHANO, THAIS C. dos A.. Expressão e caracterização do hormônio folículo estimulante (FSH) de pirarucu (Arapaima gigas) / Expression and characterization of follicle stimulating hormone (FSH) of pirarucu (Arapaima gigas). 2019. Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) - Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. 57 p.Orientador: Cibele Nunes Peroni.
DOI:
10.11606/T.85.2019.tde-18092019-085010
Abstract: O Arapaima gigas, conhecido popularmente no Brasil como pirarucu, pertence ao grupo mais primitivo dos teleósteos, sendo um dos maiores peixes de água doce da América do Sul. Desde os anos 40 informações divergentes têm sido dadas em relação ao seu tamanho e peso máximo, porém todas concordam com o fato de que se trata de uma espécie de grande porte, com exemplares pesando de 125 a 200 quilos e um comprimento de 2 a 3 metros. Sua carne é desprovida de espinhas e apresenta baixo teor de gordura. Os níveis de rendimento da carcaça são elevados e o crescimento juvenil da espécie é consideravelmente rápido. Por isso, o pirarucu, apresenta um atraente valor de mercado e grande importância para o comércio de pescado amazônico. A pesca predatória tem reduzido significativamente a população dessa espécie nas regiões amazônicas ao longo dos anos. Sendo assim, desde os anos 2000, o pirarucu foi incluído na lista de animais sobre explorados ou em perigo de extinção do IBAMA. A ausência de um empreendimento de aquicultura capaz de produzir o pirarucu a preços competitivos, de forma previsível e em larga escala deve-se principalmente ao fato de que essa espécie, de um modo geral, apresenta dificuldades no processo reprodutivo em cativeiro, apresentando uma ovulação, espermiação e/ou maturação final gonadal insatisfatória. O hormônio folículo estimulante (FSH) é um hormônio gonadotrófico que exerce um papel importante na maturação folicular inicial das gônodas. Assim como os mamíferos, os peixes também apresentam hormônios gonadotróficos (GTHs) heterodiméricos, onde a subunidade α é comum entre os hormônios pertencentes a essa família e a subunidade β determina a atividade hormonal específica. As subunidades α e β do hormônio folículo estimulante de Arapaima gigas (ag-FSH) foram previamente isoladas pelo nosso grupo de pesquisa ao longo dos anos e possibilitaram um estudo de modelagem tridimensional baseada nas sequências de aminoácidos obtidas. Paralelamente, foi realizada a expressão do ag-FSH recombinante com níveis de rendimento satisfatórios (28 mg/L) através da expressão em células de embrião de rim humano (HEK 293), purificando-o e caracterizando-o a partir de técnicas cromatográficas padronizadas pelo nosso grupo de pesquisa.
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O gerenciamento do Repositório está a cargo da Biblioteca do IPEN. Constam neste RI, até o presente momento 20.950 itens que tanto podem ser artigos de periódicos ou de eventos nacionais e internacionais, dissertações e teses, livros, capítulo de livros e relatórios técnicos. Para participar do RI-IPEN é necessário que pelo menos um dos autores tenha vínculo acadêmico ou funcional com o Instituto. Nesta primeira etapa de funcionamento do RI, a coleta das publicações é realizada periodicamente pela equipe da Biblioteca do IPEN, extraindo os dados das bases internacionais tais como a Web of Science, Scopus, INIS, SciElo além de verificar o Currículo Lattes. O RI-IPEN apresenta também um aspecto inovador no seu funcionamento. Por meio de metadados específicos ele está vinculado ao sistema de gerenciamento das atividades do Plano Diretor anual do IPEN (SIGEPI). Com o objetivo de fornecer dados numéricos para a elaboração dos indicadores da Produção Cientifica Institucional, disponibiliza uma tabela estatística registrando em tempo real a inserção de novos itens. Foi criado um metadado que contém um número único para cada integrante da comunidade científica do IPEN. Esse metadado se transformou em um filtro que ao ser acionado apresenta todos os trabalhos de um determinado autor independente das variáveis na forma de citação do seu nome.
A elaboração do projeto do RI do IPEN foi iniciado em novembro de 2013, colocado em operação interna em julho de 2014 e disponibilizado na Internet em junho de 2015. Utiliza o software livre Dspace, desenvolvido pelo Massachusetts Institute of Technology (MIT). Para descrição dos metadados adota o padrão Dublin Core. É compatível com o Protocolo de Arquivos Abertos (OAI) permitindo interoperabilidade com repositórios de âmbito nacional e internacional.
1. Portaria IPEN-CNEN/SP nº 387, que estabeleceu os princípios que nortearam a criação do RDI,
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Operando, inicialmente como uma base de dados referencial o Repositório foi disponibilizado na atual plataforma, em junho de 2015. No Repositório está disponível o acesso ao conteúdo digital de artigos de periódicos, eventos, nacionais e internacionais, livros, capítulos, dissertações, teses e relatórios técnicos.
A elaboração do projeto do RI do IPEN foi iniciado em novembro de 2013, colocado em operação interna em julho de 2014 e disponibilizado na Internet em junho de 2015. Utiliza o software livre Dspace, desenvolvido pelo Massachusetts Institute of Technology (MIT). Para descrição dos metadados adota o padrão Dublin Core. É compatível com o Protocolo de Arquivos Abertos (OAI) permitindo interoperabilidade com repositórios de âmbito nacional e internacional.
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