CLAUDIA REGINA CECCHI
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Dissertação IPEN-doc 12925 Secrecao de hormonio de crescimento de camundongo por queratinocitos humanos primarios: perspectivas para um modelo animal de terapia genica cutanea2008 - CECCHI, CLAUDIA R.Queratinócitos são um veículo bastante atrativo para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. Um eficiente vetor retroviral (LXSN) contendo o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foi utilizado para transduzir queratinócitos humanos primários. Os queratinócitos transduzidos apresentaram um nível de secreção in vitro alto e estável atingindo até 11 g mGH/106 células/dia. Os epitélios formados por estes queratinócitos geneticamente modificados apresentaram, porém, uma queda na taxa de secreção > 80 % quando foram retirados da placa de cultura utilizando um procedimento clássico. A substituição desta metodologia clássica por uma cultura organotípica resolveu completamente este problema. Camundongos anões imunodeficientes (lit/scid) implantados com estes enxertos organotípicos foram acompanhados durante 4 meses, e apresentaram um aumento de peso significativo (P<0,05) nos primeiros 40 dias. Níveis circulatórios de mGH atingiram um pico de 21 ng/mL 1 h após o implante, mas estes níveis rapidamente atingiram níveis basais (~2 ng/mL). Os queratinócitos humanos primários apresentaram portanto altos níveis de expressão in vitro e os maiores níveis circulatórios, porém por um breve período de tempo, reportados até o momento para GH neste tipo de células. Em conjunto com resultados que mostraram uma recuperação considerável da eficiência de secreção de mGH em cultura por enxertos organotípicos retirados dos animais, foram discutidos os fatores que ainda impedem a utilização clínica deste modelo promissor de terapia gênica cutânea.Tese IPEN-doc 18896 Obtenção de um modelo homólogo de terapia gênica mediante administração direta de um plasmídeo com o gene do hormônio de crescimento murino em camundongos anões imunocompetentes2013 - CECCHI, CLAUDIA R.Níveis sustentáveis de hormônio de crescimento humano (hGH) circulante e aumento de peso altamente significativo, avaliados também em comparação a repetidas injeções de hormônio, foram observados em trabalhos anteriores, baseados na eletrotransferência de DNA plasmidial no músculo de camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). No presente trabalho, um modelo animal homólogo de terapia gênica para GH foi estudado mediante clonagem da sequência genômica do DNA de GH de camundongo (mGH-gDNA), a qual substituiu o hGH-gDNA no vetor que havia sido utilizado em camundongos anões imunodeficientes. O novo vetor, agora nomeado UBI-mGH-gDNA, foi utilizado em camundongos anões imunocompetentes (lit/lit). Foi primeiramente realizado um teste in vitro, transfectando-se células humanas HEK 293 com este plasmídeo e obtendo-se uma expressão de 3,0 μg mGH/106 células/dia, contra 3,7 μg mGH/106 células/dia, para o UBI-hGH-gDNA. Estes dois plasmídeos foram então injetados (50 μg/animal) no músculo quadríceps de camundongos, seguido de eletroporação, realizando um ensaio de 94 dias. Enquanto após 15 dias, as inclinações das curvas de variação de peso relacionadas ao mGH, hGH e salina foram 0,130, 0,112 e 0,027 g/camundongo/dia, respectivamente, após 94 dias, as inclinações correspondentes foram 0,041, 0,028 e 0,033 g/camundongo/dia. As análises estatísticas mostraram que após 15 dias, as inclinações das duas curvas com o GH foram significativamente maiores que a inclinação do controle (P<0,001), enquanto que após 94 dias, somente a inclinação da curva do mGH foi maior que a do controle (P<0,005). A porcentagem de aumento de peso nos animais tratados com o gene do mGH, após 94 dias, foi de 34,3%, enquanto que o comprimento nariz-cauda e o comprimento do fêmur, dois parâmetros que medem diretamente o crescimento longitudinal, foram de 9,5% e 26%, respectivamente, quando comparados aos valores iniciais. A interrupção do crescimento progressivo do grupo tratado com hGH não foi inesperada, considerando a óbvia reação imunogênica dos animais imunocompetentes contra o GH humano e não contra o de camundongo (título do anticorpo anti-hGH 1:100 a 1:3200). A inclinação altamente positiva do grupo controle, já observada em camundongos lit/lit mas não em lit/scid, é provavelmente devida ao ganho de peso natural desta linhagem, não suportada, contudo, por um proporcional crescimento longitudinal. Níveis circulatórios de mGH da ordem de 4 ng/mL foram detectados após 15 dias para o grupo tratado com o mGH, enquanto o grupo controle apresentou níveis em torno de 0,7 ng mGH/mL (P<0,001). Níveis circulatórios de mIGF-I foram também determinados nos dias 15, 45 e 94 nos animais tratados com mGH, sempre mostrando valores 1,5 - 3,0 vezes maiores que o grupo controle, e valores 1,2-1,6 vezes maiores que o grupo tratado com hGH. Este modelo de tratamento homólogo pode ser considerado uma primeira abordagem e um importante suporte para futuros ensaios pré-clínicos baseados na administração de DNA plasmidial para o tratamento da deficiência de GH humano.