Renaturação sob alta pressão hidrostítica de tiorredoxinas de Xylella fastidiosa
| dc.contributor.advisor | Ligia Ely Morganti Ferreira Dias | pt_BR |
| dc.contributor.author | LEMKE, LAURA S. | pt_BR |
| dc.coverage | Nacional | pt_BR |
| dc.date.accessioned | 2014-10-09T12:35:30Z | pt_BR |
| dc.date.accessioned | 2014-10-09T14:04:37Z | |
| dc.date.available | 2014-10-09T12:35:30Z | pt_BR |
| dc.date.available | 2014-10-09T14:04:37Z | |
| dc.date.issued | 2012 | pt_BR |
| dc.description.abstract | Muitas das proteínas de valor biomédico relevante são encontradas em baixas concentrações em suas fontes nativas. O alto nível de expressão de proteínas recombinantes em E. coli, muitas vezes gera o acúmulo de proteínas como agregados insolúveis no citoplasma e/ou periplasma da bactéria, denominados de corpos de inclusão (CI). A alta pressão tem sido amplamente utilizada no estudo da conformação das proteínas,ela modula as interações proteína-proteína e proteína-solvente através de mudanças no volume das mesmas, promovendo a entrada de água nas cavidades não expostas da molécula e promovendo hidratação e solubilização dos agregados. O presente trabalho teve como objetivo a renaturação de proteínas recombinantes expressas como CI em Escherichia coli usando alta pressão hidrostática como condição branda de dissociação dos agregados. As tiorredoxinas TsnC e TrxA, a proteína YbbN e a proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp), todas de Xylella fastidiosa, foram estudadas neste trabalho. As condições de renaturação foram otimizadas, utilizando-se diferentes proporções do par redox, concentrações de GdnHCl, presença de aditivos e esquemas de descompressão. Para a quantificação e análise da eficácia do processo de renaturação das proteínas sob pressão foram utilizadas as técnicas de microscopia eletrônica de varredura dos CI e de SDS-PAGE, e ensaios de atividade enzimática das proteínas. A TsnC foi renaturada em Tris HCl 50 mM com proporção de 10GSH:1GSSG em concentração final de 10 mM, 0,75 M GdnHCl, na presença de 0,5 M de Triton-X e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. O rendimento final de obtenção de TsnC solúvel foi altíssimo, de até 89,9%. A renaturação de proteína YbbN, nunca antes descrita, foi obtida em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, na presença de 0,5 M de L-Arginina e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. A proteína YbbN, que apresentou atividade de tioredoxina, foi renaturada com rendimento de até 98% a partir da proteína insolúvel nos CI. Foi possível a solubilização da tiorredoxina TrxA e Bcp sob alta pressão hidrostática em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, utilizando diferentes proporções do par redox na concentração final de 10 mM e 1,5 M de GdnHCl, porém não foi possível obter a atividade biológicas destas proteínas. Mostramos também que a L-Arginina apresenta efeito auxiliar na solubilização dos CI induzida pela alta pressão, e ao mesmo tempo se mostrou altamente protetora contra a inativação da atividade da YbbN promovida pela incubação em altas temperaturas, o que sugere que a presença deste aminoácido pode ter alta aplicabilidade juntamente com a aplicação de altas pressões para elevar os rendimentos de renaturação de proteínas recombinantes a partir de CI. | pt_BR |
| dc.description.notasgerais | Dissertação (Mestrado) | pt_BR |
| dc.description.notastese | IPEN/D | pt_BR |
| dc.description.teseinstituicao | Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP | pt_BR |
| dc.format.extent | 77 | pt_BR |
| dc.identifier.citation | LEMKE, LAURA S. <b>Renaturação sob alta pressão hidrostítica de tiorredoxinas de Xylella fastidiosa</b>. Orientador: Ligia Ely Morganti Ferreira Dias. 2012. 77 f. Dissertação (Mestrado) - Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP, São Paulo. DOI: <a href="https://dx.doi.org/10.11606/D.85.2012.tde-06032013-132235">10.11606/D.85.2012.tde-06032013-132235</a>. Disponível em: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10165. | |
| dc.identifier.doi | 10.11606/D.85.2012.tde-06032013-132235 | |
| dc.identifier.uri | http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10165 | pt_BR |
| dc.local | São Paulo | pt_BR |
| dc.rights | openAccess | pt_BR |
| dc.subject | proteins | pt_BR |
| dc.subject | bacterial diseases | pt_BR |
| dc.subject | microorganisms | pt_BR |
| dc.subject | hydrostatics | pt_BR |
| dc.subject | pressurization | pt_BR |
| dc.subject | scanning electron microscopy | pt_BR |
| dc.title | Renaturação sob alta pressão hidrostítica de tiorredoxinas de Xylella fastidiosa | pt_BR |
| dc.title.alternative | Renaturation under high hidrostatic pressure of thioredoxins of Xylella fastidiosa | pt_BR |
| dc.type | Dissertação | pt_BR |
| dspace.entity.type | Publication | |
| ipen.autor | LAURA SIMONI LEMKE | |
| ipen.codigoautor | 8639 | |
| ipen.contributor.ipenauthor | LAURA SIMONI LEMKE | |
| ipen.date.recebimento | 13-02 | pt_BR |
| ipen.identifier.ipendoc | 18592 | pt_BR |
| ipen.identifier.localizacao | T547.96 / L554r | pt_BR |
| ipen.meioeletronico | http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/85/85131/tde-06032013-132235/pt-br.php | pt_BR |
| ipen.type.genre | Dissertação | |
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| relation.isAuthorOfPublication.latestForDiscovery | 69cbe232-ccf4-4d38-9389-fd0a5896f8d4 | |
| sigepi.autor.atividade | LEMKE, LAURA S.:8639:820:S | pt_BR |