ROBERTO FEITOSA DE CARVALHO
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Artigo IPEN-doc 23455 Molecular cloning and characterization of pirarucu (Arapaima gigas) follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone β-subunit cDNAs2017 - SEVILHANO, THAIS; CARVALHO, ROBERTO F. de; OLIVEIRA, NELIO A. de J.; OLIVEIRA, JOAO E.; MALTAROLLO, VINICIUS G.; TROSSINI, GUSTAVO; GARCEZ, RIVIANE; BARTOLINI, PAOLOThe common gonadotrophic hormone α-subunit (GTHα) has been previously isolated by our research group from A. gigas pituitaries; in the present work the cDNA sequences encoding FSHβ and LHβ subunits have also been isolated from the same species of fish. The FSH β-subunit consists of 126 amino acids with a putative 18 amino acid signal peptide and a 108 amino acid mature peptide, while the LH β-subunit consists of 141 amino acids with a putative 24 amino acid amino acid signal peptide and a 117 amino acid mature peptide. The highest identity, based on the amino acid sequences, was found with the order of Anguilliformes (61%) for FSHβ and of Cypriniformes (76%) for LHβ, followed by Siluriformes, 53% for FSHβ and 75% for LHβ. Interestingly, the identity with the corresponding human amino acid sequences was still remarkable: 45.1% for FSHβ and 51.4% for LHβ. Three dimensional models of ag-FSH and ag-LH, generated by using the crystal structures of h-FSH and h-LH as the respective templates and carried out via comparative modeling and molecular dynamics simulations, suggested the presence of the so-called ªseat-beltº, favored by a disulfide bond formed between the 3rd and 12th cysteine in both β-subunits. The sequences found will be used for the biotechnological synthesis of A. gigas gonadotrophic hormones (ag-FSH and ag-LH). In a first approach, to ascertain that the cloned transcripts allow the expression of the heterodimeric hormones, ag-FSH has been synthesized in human embryonic kidney 293 (HEK293) cells, preliminarily purified and characterized.Resumo IPEN-doc 21356 Molecular cloning, characterization and phylogenetic analysis of pirarucu (Arapaima gigas) FSH and LH beta-subunits2015 - BARTOLINI, PAOLO; CARVALHO, ROBERTO F.; SEVILHANO, THAIS C. dos A.; OLIVEIRA, JOAO E.; GARCEZ, RIVIANEResumo IPEN-doc 18704 Glicoprotein alpha characterization of the Amazonia fis (Arapaima gigas)2012 - CARVALHO, R.F.; SEVILHANO, T.C.A.; OLIVEIRA, N.A.J.; SOARES, C.R.J.; OLIVEIRA, J.E.; BARTOLINI, P.; SANTOS, P.R.E.; FARIA M.T.Dissertação IPEN-doc 20162 Clonagem, caracterização e análise filogenética das subunidades alfa e beta do hormônio folículo estimulante de Pirarucu (Arapalma gigas) visando sua síntese em células CHO2014 - CARVALHO, ROBERTO F. deO Pirarucu (Arapaima gigas) é um peixe gigante da família Arapaimidae, nativo das bacias amazônicas que pode chegar a dois metros de comprimento e pesar mais de 200 Kg. Está presente no Equador, na Colômbia, no Peru, na Bolívia e no Brasil. Atualmente a espécie está ameaçada de extinção devido à pesca predatória e ao aumento da presença humana em seus viveiros naturais. No presente trabalho, os cDNAs da subunidade (ag-GTHα) e da subunidade β do hormônio folículo estimulante de A. gigas (ag-FSH) foram isolados e clonados pela primeira vez, possibilitando uma melhor compreensão da diversidade e evolução desta glicoproteína em peixes e a futura síntese biotecnológica deste hormônio para fins reprodutivos e alimentícios. Tanto o cDNA do ag-GTHα quanto aquele do ag-FSHβ foram sintetizados pela reação de transcriptase reversa (RT) e pela reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando como molde RNA total proveniente das glândulas hipofisárias de A. gigas. O cDNA da subunidade ag-GTHα possui uma sequência codificadora (Open Reading Frame, ORF) de 348 pb, o que corresponde a uma proteína de 115 aminoácidos com um suposto peptídeo sinal de 24 aminoácidos e com um peptídeo maduro de 91 aminoácidos. Dez resíduos de cisteínas responsáveis pela formação de cinco pontes dissulfeto, dois sítios de N-glicosilação e três resíduos de prolinas apresentaram-se altamente conservados quando comparados com outras espécies de peixes. A comparação baseada em sequências de aminoácidos de GTHα de 38 espécies de peixes revelou alta identidade do A. gigas com membros das seguintes ordens: Acipenseriformes, Anguiliformes, Siluriformes e Cypriniformes (87,1-89,5%), e, a menor identidade com os Gadiformes e Cyprinodontiformes (55%). A identidade com a análoga sequência de GTHα de Homo sapiens foi de 67%. Para a subunidade ag-FSHβ, a ORF correspondente foi de 381 pb, produzindo uma proteína de 126 aminoácidos com um peptídeo sinal de 18 e um peptídeo maduro de 108 aminoácidos. Quando comparado com as sequências de Anguilla marmorata, Acipenser gueldenstaedtii e Homo sapiens, o peptídeo maduro de ag-FSHβ mostrou conter 12 resíduos de cisteínas responsáveis pela formação de seis pontes dissulfeto, duas prolinas e um sítio de glicosilação perfeitamente conservados, apresentando identidades de 63, 50 e 45% respectivamente em suas sequências de aminoácidos. As árvores filogenéticas construídas mostraram, em geral, que o A. gigas, da ordem dos Osteoglossiformes, se apresenta como grupo irmão dos Clupeocefala, enquanto os Elopomorpha (Anguiliformes) formam o grupo mais basal de todos os teleósteos aqui analisados.Artigo IPEN-doc 18812 Isolation of the pituitary gonadotrophic 'alpha'-subunit hormone of the giant amazonian fish: pirarucu (Arapaima gigas)2013 - FARIA, M.T.; CARVALHO, R.F.; SEVILHANO, T.C.A.; OLIVEIRA, N.A.J.; SILVA, C.F.P.; OLIVEIRA, J.E.; SOARES, C.R.J.; GARCEZ, R.; SANTO, P.R.E.; BARTOLINI, P.