ERIC KINNOSUKE MARTINS UEDA
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Tese IPEN-doc 11467 Prolactina humana pseudofosforilada (S179D-hPRL) é um potente fator anti-angiogênico in vitro e in vivo2006 - UEDA, ERIC K.M.S179D prolactina (hPRL) é uma mímica molecular da prolactina humana fosforilada. Demonstrou-se que a S179D-hPRL era anti angiogênica nos ensaios de angiogênese baseados na membrana corialantóica de galinha e na córnea de camundongos. Investigações posteriores realizadas empregando modelos in vitro demonstraram que o tratamento com S179D-hPRL diminuiu o número de células viáveis, reduziu a formação de túbulos em Matrigel e interferiu com a migração e invasão da matriz extracelular. A análise dos fatores de crescimento de células endoteliais humanas tratadas com S179D-hPRL revelou: uma diminuição na expressão ou liberação da PRL endógena, da heme-oxigenase-1, do fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF) e um aumento na expressão de dois inibidores teciduais de metaloproteases. A S179D-hPRL também bloqueou a sinalização provocada por bFGF nessas células. Nós concluímos que essa mímica molecular do hormônio pituitário fosforilado é uma potente proteína anti-angiogênica, em parte devido á sua habilidade de reduzir o estímulo autócrino de fatores de crescimento de células endoteliais de cordão umbilical humano (HUVEC), por sua capacidade de bloquear a sinalização promovida pelo bFGF e por sua habilidade de interferir na migração endotelial. Também foi estudada a influência da S179D-hPRL na apoptose em células endoteliais humanas, empregando caspase-8 como um marcador da via extrínseca, e a liberação de citocromo C como um marcador da via intrínseca. As duas cascatas convergem na ativação da caspase-3, que cliva a fator de fragmentação de DNA (DFF45). Uma incubação de três dias com 50 ng/mL de S179D-hPRL quadruplicou o número de células apoptóticas; esse efeito duplicou-se com uma concentração de 100 ng/mL e atingiu um ápice com 500 ng/mL. A clivagem de DFF45 e da pro-caspase-8 foi detectado com 100 ng/mL. Citocromo C, porém, só foi observado com concentrações de 500 ng/mL. O regulador de ciclo celular p21 (um marcador pró-apoptótico) elevou-se com 100 ng/mL, enquanto que um incremento do supressor tumoral p53 necessitou três vezes o tempo de incubação e 500 ng/mL. A atividade do promotor de p21 foi máxima com 50 ng/mL do análogo de hPRL, enquanto que 500 ng/mL foram necessários para se visualizar uma alteração significativa na atividade do promotor de Bax (um indicador da atividade de p53). Como previamente demonstrado na literatura, S179D-hPRL bloqueou a fosforilação da quinase regulada extracelularmente (ERK) em resposta ao bFGF, mas também causou uma ativação tardia e prolongada da ERK. PD 98059 [inibidor específico da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPkinase)] inibiu essa ativação tardia e sustentada assim como outros efeitos da S179D-hPRL, exceto aquele sobre a indução de p53 e ativação do promotor de Bax. Podemos concluir que baixas doses de S179D-hPRL bloqueiam a sinalização de ERK induzida por bFGF e concomitantemente ativam a ERK em um tempo diferente, resultando na elevação de p21 e ativando a via extrínseca de apoptose. Maiores tempos de incubação e concentração, entretanto, ativam a via intrínseca empregando uma cascata intracelular diferente. Esses achados sugerem que níveis circulantes de PRL fosforilada podem inibir a progressão do câncer e, portanto, S179D-hPRL poderia ser um agente anti-angiogênico útil na terapêutica.Artigo IPEN-doc 14063 A molecular mimic of phosphorylated prolactin (S179D PRL) secreted by eukaryotic cells has a conformation with an increased positive surface charge compared to that of unmodified prolactin2009 - UEDA, ERIC K.M.; SOARES, CARLOS R.J.; BARTOLINI, PAOLO; GUZMAN, ARIEL de; LORENSON, MARY Y.; WALKER, AMEAE M.Artigo IPEN-doc 11409 A molecular mimic demonstrates that phosphorylated human prolactin is a potent anti-angiogenic hormone2006 - UEDA, ERIC; OZERDEM, UGUR; CHEN, YEN-HAO; YAO, MIN; HUANG, KUANG T.; SUN, HUIQIN; GREEN, MANUELA, M.; BARTOLINI, PAOLO; WALKER, A.M.Artigo IPEN-doc 11417 Physico-chemical and biological characterizations of two human prolactin analogs exhibiting controversial bioactivity, synthesized in chinese hamster ovary (CHO) cells2006 - SOARES, C.R.J.; GLEZER, A.; OKAZAKI, K.; UEDA, E.K.M.; HELLER, S.R.; WALKER, A.M.; GOFFIN, V.; BARTOLINI, P.The synthesis, puriWcation and characterization of G129R–hPRL and S179D–hPRL, the two better-studied antagonists of human prolactin (hPRL), is described. Both of these have been expressed for the Wrst time, in their authentic form, by a stable CHO cell line, at secretion levels of 7.7 and 4.3 g/106 cells/day, respectively. Previous studies had shown that these hPRL analogs, when produced in bacterial cytoplasm, consistently contained misfolded forms and multimers according to the speciWc denaturation, refolding and puriWcation conditions. These versions also have an N-terminal extra methionine. An extensive physico-chemical characterization was carried out after a practical two-step puriWcation process and included SDS–PAGE and Western blotting analysis, matrix-assisted laser-desorption ionization time-of-Xight mass spectral (MALDI–TOF–MS) analysis, high-performance size-exclusion chromatography (HPSEC) and reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP–HPLC). This last technique revealed a considerable diVerence in hydrophobicity due to a single amino acid substitution, with S179D–hPRL less (tRR D 0.85 § 0.010) and G129R–hPRL more (tRR D 1.10§ 0.013) hydrophobic than hPRL, where tRR is the relative retention time. The biological characterization was based on further reWnement of a sensitive proliferation assay using the pro-B murine cell line (Ba/F3) transfected with the long form hPRL receptor cDNA such that the minimal detectable dose was 0.04 ng of hPRL/mL, the Ba/F3-LLP assay. On the basis of this assay, the relative residual agonistic activity of these two products, determined against a hPRL international standard in four independent assays, was 53 £ 10¡3 for S179D–hPRL and 70£ 10¡5 for G129R–hPRL. We believe that the present synthesis and characterization could be extremely helpful for studies of these two proteins, which have been reported to antagonize tumor growth-promoting eVects of hPRL in vivo in animal models of breast and prostate cancer.