LARISSA ANDRADE ALMEIDA
4 resultados
Resultados de Busca
Agora exibindo 1 - 4 de 4
Artigo IPEN-doc 30609 Radiolabeling of porcine, murine growth hormone and a potential antagonist G118R-mGH for biodistribution study2024 - NUNES, A.P.; MENEZES, F.; ALMEIDA, L.A.; POMIN, S.A.; FALCAO, P.L.; SOARES, C.R.J.Dissertação IPEN-doc 30330 Expressão, purificação e caracterização de gonadotrofina coriônica humana produzida em células CHO cultivadas em suspensão2023 - ALMEIDA, LARISSA A.A gonadotrofina coriônica humana (hCG) é um hormônio glicoproteico de 237 aminoácidos, cuja glicoforma regular apresenta cerca de 37.180 Da, sendo 30 % dessa massa molecular composta por açúcares. Este hormônio é produzido fisiologicamente em grandes quantidades pelas células sinciciotrofoblásticas das vilosidades placentárias durante a gravidez, onde exerce a função de estimular a produção de progesterona e manter o corpo lúteo, nas primeiras 6 semanas da gestação, enquanto a placenta se desenvolve. Também está bem estabelecido que altos níveis de β-hCG estão relacionados com a malignidade tumoral. A hCG assim como os hormônios FSH, LH e TSH, é uma proteína heterodimérica, ou seja, formada por duas subunidades: subunidade α em comum com os outros hormônios citados e subunidade β que confere características específicas para cada hormônio. O objetivo deste trabalho é expressar a gonadotrofina coriônica humana recombinante (r-hCG) em linhagem de células CHO em suspensão, purificar e caracterizar a hCG obtida. Na metodologia empregada para produção deste hormônio, foram construídos dois plasmídeos, um para a expressão da subunidade α e outro para a β. Após a confirmação do sequenciamento, os plasmídeos contendo o cDNA foram empregados para transfectar de forma transiente as células ExpiCHO-S, utilizando lipídeo catiônico (lipofectamina). Na transfecção transiente a proporção dos plasmídeos com as subunidades α e β foram avaliados, a relação 1α:1β foi a que se mostrou mais eficiente durante oito dia de produção. O processo de purificação consistiu de uma troca aniônica seguida por uma exclusão molecular e o hCG obtido apresentou alto grau de pureza. O r-hCG confirmou atividade imunológica por Western Blotting e ELISA. A atividade biológica in vitro foi confirmada por estudos de proliferação celular e citometria de fluxo utilizando células intersticiais de testículo de camundongo mLTC-1 (células de Leydig). Também foram realizadas análises por MALDI-TOF/TOF para determinar a porcentagem de N-glicanos e O-glicanos em cada subunidade do hCG. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que a gonadotrofina coriônica humana recombinante, produzida e purificada em nosso laboratório, atende aos requisitos de autenticidade, pureza e eficácia necessária para sua aplicação, seja para a utilização in vitro ou em ensaios biológicos.Artigo IPEN-doc 27769 Periplasmic synthesis and purification of the human prolactin antagonist Δ1‑11‑G129R‑hPRL2021 - SUZUKI, MIRIAM F.; ALMEIDA, LARISSA A.; POMIN, STEPHANIE A.; SILVA, FELIPE D.; FREIRE, RENAN P.; OLIVEIRA, JOAO E.; AFFONSO, REGINA; SOARES, CARLOS R.J.; BARTOLINI, PAOLOThe human prolactin antagonist Δ1-11-G129R-hPRL is a 21.9 kDa recombinant protein with 188 amino acids that downregulates the proliferation of a variety of cells expressing prolactin receptors. Periplasmic expression of recombinant proteins in E. coli has been considered an option for obtaining a soluble and correctly folded protein, as an alternative to cytoplasmic production. The aim of this work was, therefore, to synthesize for the first time, the Δ1-11-G129R-hPRL antagonist, testing different activation temperatures and purifying it by classical chromatographic techniques. E. coli BL21(DE3) strain was transformed with a plasmid based on the pET25b( +) vector, DsbA signal sequence and the antagonist cDNA sequence. Different doses of IPTG were added, activating under different temperatures, and extracting the periplasmic fluid via osmotic shock. The best conditions were achieved by activating at 35 °C for 5 h using 0.4 mM IPTG, which gave a specific expression of 0.157 ± 0.015 μg/mL/A600 at a final optical density of 3.43 ± 0.13 A600. Purification was carried out by nickel-affinity chromatography followed by size-exclusion chromatography, quantification being performed via high-performance size-exclusion chromatography (HPSEC). The prolactin antagonist was characterized by SDS-PAGE, Western blotting, reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) and MALDI-TOF–MS. The final product presented > 95% purity and its antagonistic effects were evaluated in vitro in view of potential clinical applications, including inhibition of the proliferation of cancer cells overexpressing the prolactin receptor and specific antidiabetic properties, taking also advantage of the fact that this antagonist was obtained in a soluble and correctly folded form and without an initial methionine.Resumo IPEN-doc 27524 Avaliação do cultivo de células CHO adaptadas a suspensão em diferentes formulações de meios de cultura comerciais livres de soro2020 - ALMEIDA, LARISSA A.; SOARES, CARLOS R.J.