FERNANDA DOS SANTOS ARTHUSO

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Influência da temperatura de cultivo na expressão de proteínas recombinantes de interesse terapêutico no espaço periplásmico bacteriano, utilizando o promotor lambda PL
2015 - PEREZ, FERNANDA dos S.A.
O sistema de expressão baseado nos promotores PL ou PR do fago lambda que usualmente é regulado pelo repressor termo lábil (cIts) é amplamente utilizado para produzir proteínas recombinantes em células procarióticas. No entanto, o aumento da temperatura requerido neste sistema para promover a inativação do repressor apresenta algumas limitações, como o aumento da expressão de proteínas de HSP (Heat Shock Proteins), por exemplo, proteases, que dependendo da natureza da proteína expressa podem ser prejudiciais ou não. Uma outra limitação é a ativação da resposta SOS, resultando na parada da replicação do DNA celular ou dependendo da cepa pode ocorrer lise celular. Nesse trabalho nós descrevemos o uso do promotor λPL para expressão constitutiva, isto é, sem a regulação do repressor. Nós otimizamos diferentes condições de cultura para aumentar a secreção no espaço periplásmico de Escherichia coli de cinco proteínas: o hormônio do crescimento humano (hGH), que tem sido amplamente utilizado no tratamento de crianças com deficiência e/ou resistência ao hGH, síndrome de Turner, entre outras desordens; prolactina humana (hPRL), um hormônio polipeptídico conhecido por estimular a lactação e por exercer ação regulatória no crescimento e na diferenciação da glândula mamária, dois antagonistas de hPRL, estudados como potenciais fármacos para o tratamento de alguns tipos de cânceres e por fim o interferon α2a (IFN-α2a), que é uma citocina produzida pelas células, em resposta a diferentes estímulos, incluindo ácidos nucléicos virais, células estranhas (particularmente as neoplásicas), antígenos de bactérias, protozoários e vírus. No caso do IFN-α2a, essa citocina de alto valor agregado e de importante aplicação terapêutica, foi desenvolvida em nosso laboratório como parte desse trabalho, incluindo o desenvolvimento e a validação da metodologia de análise por HPLC de fase reversa para determinação do IFN presente no fluído periplásmico bacteriano ou na sua forma pura. As principais estratégias utilizadas para melhorar a expressão foram iniciar a indução junto à densidade óptica máxima do crescimento bacteriano e otimizar a temperatura de indução para controlar a expressão da proteína heteróloga. Essa metodologia pode ser utilizada nos casos onde o produto não será tóxico para a célula hospedeira ou quando a instabilidade do plasmídeo não é problema. A possibilidade de cultivo em temperaturas mais baixas, já que o repressor termo-sensível não se encontra presente, colaborou para o aumento significativo da expressão, mesmo para proteínas menos sensíveis à temperatura de cultivo, como o hGH.
The influence of Escherichia coli cultivation temperature on interferon alpha 2a expression (IFN-'alfa'2a)
2014 - ARTHUSO, FERNANDA dos S.; SUZUKI, MIRIAM F.; OLIVEIRA, NELIO A. de J.; OLIVEIRA, JOAO E. de; BARTOLINI, PAOLO; SOARES, CARLOS R.J.
Cycloheximide increases the synthesis of recombinant glycosylated human prolactin (G-hPRL) secreted by CHO cells
2008 - SOARES, C.R.J.; HELLER, S.R.; OLIVEIRA, T.L.; ARTHUSO, F.; GOULART, H.R.; BARTOLINI, P.
Influence of activation temperature on the degradation of recombinant proteins in E.coli
2008 - OLIVEIRA, T.L.; HELLER, S.R.; ARTHUSO, F.; SOARES, C.R.J.; BARTOLINI, P.
Two-step purification of mouse prolactin expressed in the periplasmic space of Escherichia coli
2010 - SUZUKI, MIRIAM F.; ARTHUSO, FERNANDA dos S.; SOUZA, JOSE M.; OLIVEIRA, JOAO E.; OLIVEIRA, TAIS L.; OLIVEIRA, NELIO A. de J.; GOULART, HERBERT R.; CAPONE, MARCOS V.N.; BARTOLINI, PAOLO; SOARES, CARLOS R.J.
The influence of Escherichia coli cultivation temperature on interferon alpha expression (IFN-'alfa'2a)
2013 - ARTHUSO, FERNANDA dos S.; SUZUKI, MIRIAM F.; OLIVEIRA, NELIO A. de J.; OLIVEIRA, JOAO E. de; BARTOLINI, PAOLO; SOARES, CARLOS R.J.
Expressão de prolactina de camundongos no espaço periplastico de Escherichia coli
2009 - SUZUKI, MIRIAM F.; ARTHUSO, FERNANDA dos S.; SOUZA, JOSE M.; OLIVEIRA, JOAO E.; OLIVEIRA, TAIS L.; OLIVEIRA, NELIO A. de J.; BARTOLINI, PAOLO; SOARES, CARLOS R.J.
A prolactina é um neuro hormônio que faz parte da superfamília das citocinas e está envolvida em mais de 300 processos biológicos. Considerando-se a diferença de 41% encontrada na seqüência de aminoácidos da prolactina de camundongo em relação à humana, os experimentos que utilizam a prolactina humana em modelos animais (ratos ou camundongos), podem sofrer interferência de forma decisiva na interpretação dos resultados em estudos de doenças crônicas como o lúpus eritematoso sistêmico e a artrite reumatóide Nesse trabalho introduzimos o cDNA da prolactina de camundongo (mPRL) junto com o gene do peptídio sinalizador DsbA em um cassete de expressão bacteriano desenvolvido em nosso laboratório que utiliza o promotor λPL. Esse plasmídeo foi utilizado para transformar diferentes cepas de Escherichia coli e o clone com expressão periplásmica mais eficiente foi selecionado para estudo de expressão, purificação e caracterização físico-química e biológica da mPRL.