Clonagem, expressão, purificação e caracterização estrutural da região AP-1 da oncoproteína Jun

Abstract

A proteína jun é um dos principais integrantes do complexo AP-1 e está envolvido nos processos inflamatórios, diferenciação, apoptose e migração celular. Esta proteína pode formar homodímeros e heterodímeros por meio da dimerização que ocorre pelo sítio de sequências de leucinas. Existem evidências de que a proteína jun pode ser inibida pela proteína RPL10 mediante a ligação destas proteínas, no mesmo sítio de sequências de leucinas no núcleo celular, parando a progressão de tumores. O objetivo deste trabalho foi expressar, isolar e caracterizar a região de ligação das sequências de leucinas (região AP-1), para estudos posteriores de ligação com a proteína RPL10. O cDNA para proteína jun foi amplificado por PCR e clonado nos vetores de expressão pET 26b(+), pET 28a-c(+) e p1813 e expressa em E.coli BL21 (DE3). A proteína expressa em vetor pET28_AP1 foi eficientemente purificada pela técnica de cromatografia de afinidade a íons metálicos, por possuir uma sequência (poli)histidina que facilitou a purificação, apresentando um excelente grau de pureza. A identidade da proteína foi confirmada através de análise feita por western blotting e dot blotting e também por analise por espectrometria de massas.