Clonagem, caracterização e análise filogenética das subunidades alfa e beta do hormônio luteinizante de pirarucu (Arapaima gigas)

Abstract

O Arapaima gigas, conhecido popularmente como pirarucu é uma espécie de peixe pertencente à ordem dos Osteoglossiformes, nativo da Bacia Amazônica e autóctone da Bacia de São Francisco e do Nordeste. É considerado um dos maiores peixes de água doce do mundo, chegando, na fase adulta, a três metros de comprimento e mais de 200 kg de peso, possuindo, portanto, uma grande importância para a alimentação e o comércio da região. Infelizmente esta espécie pertence à lista de animais sobre explorados do IBAMA, também em perigo de extinção, devido especialmente à pesca predatória e à sua dificuldade reprodutiva em cativeiro. Por estas razões, desenvolvemos o presente trabalho de clonagem e caracterização de um de seus hormônios da reprodução (gonadotrofinas), em particular o hormônio luteinizante (LH). Esta glicoproteína é constituída por duas subunidades ligadas de forma não covalente: a subunidade α (GTHα) comum também ao hormônio folículo estimulante (FSH) e a subunidade β, que confere a especificidade de sua ação biológica. Tanto o cDNA do ag-GTHα quanto aquele do ag-LHβ foram sintetizados pela reação de transcriptase reversa (RT) e pela reação de cadeia de polimerase (PCR) utilizando vários primers, a partir do RNA total obtido das glândulas hipofisárias de A.gigas. O cDNA de GTHα apresentou um comprimento total de 767 pb incluindo uma cadeia poli-A de 20 adeninas. Foi identificada uma região codificante (ORF) de 348 pb iniciando com o primeiro códon (ATG) na posição 58 e o códon de parada (stop) na posição 403. O sinal de poliadenilação (ATTAAA) foi localizado 18 pb antes da cauda poli-A. A região codificante traduz um peptídeo de 115 aminoácidos, com um sítio de clivagem do peptídeo sinalizador situado entre o aminoácido 24 e 25. A proteína apresenta portanto um suposto peptídeo sinal de 24 aminoácidos e um peptídeo maduro de 91 aminoácidos, que quando alinhado com outras espécies de peixes, mostra a conservação de 10 resíduos de cisteína, 3 prolinas e dois potenciais sítios de glicosilação entre os aminoáciodos 51-53 (NIT) e os aminoáciodos 77-79 (NHT). O cDNA de ag-LHβ apresenta um comprimento total de 711 pb, incluindo uma cadeia poli-A de 18 adeninas. Foi identificada uma região codificante (ORF) de 426 pb, iniciando com primeiro códon (ATG) na posição 47 e terminando na posição 469. O sinal de poliadenilação (AATAAA) foi localizado 18 pb antes da cadeia poli-A. A região codificante traduz um peptídeo sinalizador situado entre o aminoácido 24 e 25. Com isso, temos um peptídeo sinalizador de 24 e um peptídeo maduro de 117 aminoácidos que apresenta a conservação de 12 resíduos de cisteína, 6 prolinas e um sítio potencial de N-glicosilação identificado entre os aminoácidos 10-12 (NQT), enquanto um segundo possível sítio de N-glicosilação (alterado para QTT), entre os aminoácidos 27-29, foi perdido. Como na subunidade GTHα, a maior porcentagem de identidade de LHβ foi com os Cypriniformes (75.6%) enquanto a menor foi com os Gadiformes (53.8%). A análise filogenética realizada utilizando as sequências de FSHβ e LHβ de 41 espécies de peixes, incluido o A.gigas, confirmou os dados publicados relativos à subunidade GTHα, posicionando o A.gigas como grupo irmão dos Clupeocephala e os Elopomorpha (Anguilliformes) como grupo mais basal entre os teleósteos .