Expressão, purificação e caracterização de gonadotrofina coriônica humana produzida em células CHO cultivadas em suspensão

Abstract

A gonadotrofina coriônica humana (hCG) é um hormônio glicoproteico de 237 aminoácidos, cuja glicoforma regular apresenta cerca de 37.180 Da, sendo 30 % dessa massa molecular composta por açúcares. Este hormônio é produzido fisiologicamente em grandes quantidades pelas células sinciciotrofoblásticas das vilosidades placentárias durante a gravidez, onde exerce a função de estimular a produção de progesterona e manter o corpo lúteo, nas primeiras 6 semanas da gestação, enquanto a placenta se desenvolve. Também está bem estabelecido que altos níveis de β-hCG estão relacionados com a malignidade tumoral. A hCG assim como os hormônios FSH, LH e TSH, é uma proteína heterodimérica, ou seja, formada por duas subunidades: subunidade α em comum com os outros hormônios citados e subunidade β que confere características específicas para cada hormônio. O objetivo deste trabalho é expressar a gonadotrofina coriônica humana recombinante (r-hCG) em linhagem de células CHO em suspensão, purificar e caracterizar a hCG obtida. Na metodologia empregada para produção deste hormônio, foram construídos dois plasmídeos, um para a expressão da subunidade α e outro para a β. Após a confirmação do sequenciamento, os plasmídeos contendo o cDNA foram empregados para transfectar de forma transiente as células ExpiCHO-S, utilizando lipídeo catiônico (lipofectamina). Na transfecção transiente a proporção dos plasmídeos com as subunidades α e β foram avaliados, a relação 1α:1β foi a que se mostrou mais eficiente durante oito dia de produção. O processo de purificação consistiu de uma troca aniônica seguida por uma exclusão molecular e o hCG obtido apresentou alto grau de pureza. O r-hCG confirmou atividade imunológica por Western Blotting e ELISA. A atividade biológica in vitro foi confirmada por estudos de proliferação celular e citometria de fluxo utilizando células intersticiais de testículo de camundongo mLTC-1 (células de Leydig). Também foram realizadas análises por MALDI-TOF/TOF para determinar a porcentagem de N-glicanos e O-glicanos em cada subunidade do hCG. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que a gonadotrofina coriônica humana recombinante, produzida e purificada em nosso laboratório, atende aos requisitos de autenticidade, pureza e eficácia necessária para sua aplicação, seja para a utilização in vitro ou em ensaios biológicos.