Preparacao e caracterizaco das subunidades alfa e beta dos hormonios glicoproteicos humanos recombinantes: foliculotrofina, luteotrofina, tireotrofina e sua comparacao com os produtos hipofisarios

Abstract

Neste trabalho é descrito um método prático e eficiente para dissociar, em subunidades &alpha; e &beta;, quantidades pequenas (da ordem de microgramas) dos hormônios foliculotrofina (hFSH), luteotrofina (hLH) e tireotrofina (hTSH) humana, nativos e recombinantes. A dissociação destes hormônios foi conseguida incubando-os, durante 16 horas, a 37ºC, com diferentes concentrações de ácido acético: 3M, 5M e 0,4M respectivamente para o hFSH, hLH e hTSH. Nestas condições, uma eficiência de dissociação acima de 98% foi obtida. Esta eficiência foi calculada com base nas determinações de massa dos heterodímeros e das subunidades, realizadas por MALDI-TOF-MS. Uma separação rápida e quantitativa das subunidades, com rendimentos da ordem de 80-90%, foi conseguida por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) em uma coluna C4. As subunidades foram caracterizadas quanto à pureza, hidrofobicidade, massa molecular e distribuição de carga por HPLC de exclusão molecular e fase reversa, SDS-PAGE e focalização isoelétrica. Quando analisadas quanto à hidrofobicidade, as subunidades mostraram-se aproximadamente iguais, enquanto as subunidades &beta; dos três heterodímeros apresentaram a seguinte escala de hidrofobicidade: &beta;-hFSH < &beta;-hTSH < &beta;-hLH. Com relação à massa molecular relativa (Mr), as subunidades &alpha; e &beta; do hFSH apresentaram as maiores Mr enquanto as subunidades do hLH as menores. A distribuição dos isômeros de carga das subunidades dos três hormônios ocorreu em uma região ácida, para o hFSH, em uma região básica, para o hLH e em uma região intermediária, para o hTSH. As subunidades &alpha; dos três hormônios, quando analisadas via SDS-PAGE, apresentaram praticamente a mesma mobilidade eletroforética, enquanto as subunidades &beta; apresentaram diferentes taxas de migração (mR), sendo mR &beta;-hFSH < mR &beta;-hTSH < mR &beta;-hLH. Diferenças relativas à massa molecular, hidrofobicidade, migração eletroforética e distribuição de carga foram encontradas entre as preparações recombinantes e hipofisárias dos três hormônios. O método descrito é suave, prático e flexível e pode ser adaptado à dissociação de outras glicoproteínas heterodiméricas recombinantes ou nativas. Permite não só estudos e caracterização direta de cada subunidade, como também detectar a presença de subunidades livres em preparações farmacêuticas, que são contaminantes indesejáveis, sendo, portanto, uma ferramenta extremamente útil para o controle de qualidade de produtos farmacêuticos.