Síntese do hormônio de crescimento de camundongo e de seu antagonista G118R-mGH em células HEK293F cultivadas em suspensão e radiomarcação para estudos por SPECT-CT em camundongos

Abstract

Introdução: O hormônio de crescimento murino (mGH) é uma proteína de 21,8 kDa que consiste em 190 aminoácidos. Contém quatro resíduos de cisteína e duas ligações dissulfeto, semelhante ao hormônio de crescimento humano e aos de outros vertebrados. Para determinados estudos utilizando modelos animais murinos é preferível o uso espécie-específico do hormônio, para evitar a tolerância à exposição, desenvolvimento de respostas imunes e interação com outros receptores. Os camundongos lit/lit apresentam uma diminuição dos níveis do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) e fenótipo anão que podem ser revertidos com a aplicação do hormônio nos estágios iniciais do desenvolvimento do animal. A síntese inédita de um potencial antagonista de camundongo, G118R-mGH, com uma mutação no códon de glicina (G) no aminoácido 118, substituído por arginina (R), que permite que o sítio 1 se ligue ao receptor do hormônio do crescimento (GHR), mas impede a ligação funcional no sítio 2, inviabilizando a sinalização intracelular, pode contribuir para um maior entendimento da ação do GH no sistema nervoso. Objetivo: Obter mGH e G118R-mGH em células de rim de embrião humano (HEK293F), purificar e radiomarcar a fim de investigar os efeitos fisiológicos da sua ação em camundongos. Metodologia: Esse trabalho foi dividido em cinco etapas: a síntese de DNA, com a construção do vetor pcDNA 3.4 TOPO, inserindo a sequência codificadora do hormônio mGH e de seu antagonista G118R-mGH, seguinda da transformação de bactéria Escherichia coli para obter quantidade de plasmídeo suficiente para transfecção. Na segunda parte do trabalho, realizamos a expressão, por transfecção transiente, desses hormônios em cultura de células HEK293F em suspensão, avaliando o melhor dia de produção mediante eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e western blotting. Na terceira etapa, realizamos a purificação utilizando as técnicas cromatográficas de troca iônica seguida de exclusão molecular. Na quarta etapa foi realizado o bioensaio em camundongos lit/lit com administração intraperitoneal de 10 μg/dia das proteínas com duração de 10 dias, e a análise com base na variação de massa corporal. A quinta e última etapa envolveu a radiomarcação do mGH e G118R-mGH com ¹³¹I e ¹²³I, seguida de ensaio in vivo de biodistribuição e SPECT-CT. Resultados: A produção em células de mamífero apresentou níveis mais elevados de expressão das proteínas recombinantes no quarto dia de produção. O mGH e seu antagonista foram purificados e caracterizados por técnicas físico química (SDS-PAGE, WB, HPLC, MS). Foram produzidos cerca de 1 mg de proteína de interesse para cada 10 mL de cultura, com pureza superior a 90% e com concentração da ordem de 0,1 mg/mL. No bioensaio, o tratamento com mGH apresentou aumento da massa corporal, similar ao hGH usado como controle, enquanto o G118R-mGH, na mesma dose, não apresentou crescimento. A pureza do radiomarcado foi acima de 90% e no estudo com SPECT-CT ocorreu dispersão por todo o corpo de ambas as proteínas e principalmente em várias regiões cerebrais. Conclusões: A produção e purificação do mGH e do G118R-mGH foram obtidas com êxito e os estudos com radiomarcação e dos estudos in vivo demonstraram uma diferença de atividade e biodistribuição, possivelmente relacionadas com diferenças nas ligações com o GHR, o que abre caminho para futuras pesquisas.