AMANDA PALERMO NUNES
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Artigo IPEN-doc 30615 The role of Prolactin (PRL) in activating the signaling pathways of the Jak STAT complex as a potential candidate in radioresistant MDAMB-231 cells in 3D cultures2024 - FALCAO, P.L.; VIEIRA, D.P.; SILVA, G.D. da; NUNES, A.P.; MENEZES, F.; PRUDENTE, S.R.; SILVA, T.M. da; SANTOS, E.C. dos; PAZ, M.M.; SOARES, C.R.J.Artigo IPEN-doc 30609 Radiolabeling of porcine, murine growth hormone and a potential antagonist G118R-mGH for biodistribution study2024 - NUNES, A.P.; MENEZES, F.; ALMEIDA, L.A.; POMIN, S.A.; FALCAO, P.L.; SOARES, C.R.J.Artigo IPEN-doc 30399 The pattern of GH action in the mouse brain2024 - MENEZES, FILIPE; WASINSKI, FREDERICK; SOUZA, GABRIEL O. de; NUNES, AMANDA P.; BERNARDES, EMERSON S.; SANTOS, SOFIA N. dos; SILVA, FABIO F.A. da; PERONI, CIBELE N.; OLIVEIRA, JOAO E.; KOPCHICK, JOHN J.; BROWN, ROSEMARY S.E.; FERNANDEZ, GIMENA; DE FRANCESCO, PABLO N.; PERELLO, MARIO; SOARES, CARLOS R.J.; DONATO JUNIOR, JOSEGH acts in numerous organs expressing the GH receptor (GHR), including the brain. However, the mechanisms behind the brain's permeability to GH and how this hormone accesses different brain regions remain unclear. It is well-known that an acute GH administration induces phosphorylation of the signal transducer and activator of transcription 5 (pSTAT5) in the mouse brain. Thus, the pattern of pSTAT5 immunoreactive cells was analyzed at different time points after IP or intracerebroventricular GH injections. After a systemic GH injection, the first cells expressing pSTAT5 were those near circumventricular organs, such as arcuate nucleus neurons adjacent to the median eminence. Both systemic and central GH injections induced a medial-to-lateral pattern of pSTAT5 immunoreactivity over time because GH-responsive cells were initially observed in periventricular areas and were progressively detected in lateral brain structures. Very few choroid plexus cells exhibited GH-induced pSTAT5. Additionally, Ghr mRNA was poorly expressed in the mouse choroid plexus. In contrast, some tanycytes lining the floor of the third ventricle expressed Ghr mRNA and exhibited GH-induced pSTAT5. The transport of radiolabeled GH into the hypothalamus did not differ between wild-type and dwarf Ghr knockout mice, indicating that GH transport into the mouse brain is GHR independent. Also, single-photon emission computed tomography confirmed that radiolabeled GH rapidly reaches the ventral part of the tuberal hypothalamus. In conclusion, our study provides novel and valuable information about the pattern and mechanisms behind GH transport into the mouse brain.Dissertação IPEN-doc 30325 Síntese do hormônio de crescimento de camundongo e de seu antagonista G118R-mGH em células HEK293F cultivadas em suspensão e radiomarcação para estudos por SPECT-CT em camundongos2023 - NUNES, AMANDA P.Introdução: O hormônio de crescimento murino (mGH) é uma proteína de 21,8 kDa que consiste em 190 aminoácidos. Contém quatro resíduos de cisteína e duas ligações dissulfeto, semelhante ao hormônio de crescimento humano e aos de outros vertebrados. Para determinados estudos utilizando modelos animais murinos é preferível o uso espécie-específico do hormônio, para evitar a tolerância à exposição, desenvolvimento de respostas imunes e interação com outros receptores. Os camundongos lit/lit apresentam uma diminuição dos níveis do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) e fenótipo anão que podem ser revertidos com a aplicação do hormônio nos estágios iniciais do desenvolvimento do animal. A síntese inédita de um potencial antagonista de camundongo, G118R-mGH, com uma mutação no códon de glicina (G) no aminoácido 118, substituído por arginina (R), que permite que o sítio 1 se ligue ao receptor do hormônio do crescimento (GHR), mas impede a ligação funcional no sítio 2, inviabilizando a sinalização intracelular, pode contribuir para um maior entendimento da ação do GH no sistema nervoso. Objetivo: Obter mGH e G118R-mGH em células de rim de embrião humano (HEK293F), purificar e radiomarcar a fim de investigar os efeitos fisiológicos da sua ação em camundongos. Metodologia: Esse trabalho foi dividido em cinco etapas: a síntese de DNA, com a construção do vetor pcDNA 3.4 TOPO, inserindo a sequência codificadora do hormônio mGH e de seu antagonista G118R-mGH, seguinda da transformação de bactéria Escherichia coli para obter quantidade de plasmídeo suficiente para transfecção. Na segunda parte do trabalho, realizamos a expressão, por transfecção transiente, desses hormônios em cultura de células HEK293F em suspensão, avaliando o melhor dia de produção mediante eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e western blotting. Na terceira etapa, realizamos a purificação utilizando as técnicas cromatográficas de troca iônica seguida de exclusão molecular. Na quarta etapa foi realizado o bioensaio em camundongos lit/lit com administração intraperitoneal de 10 μg/dia das proteínas com duração de 10 dias, e a análise com base na variação de massa corporal. A quinta e última etapa envolveu a radiomarcação do mGH e G118R-mGH com ¹³¹I e ¹²³I, seguida de ensaio in vivo de biodistribuição e SPECT-CT. Resultados: A produção em células de mamífero apresentou níveis mais elevados de expressão das proteínas recombinantes no quarto dia de produção. O mGH e seu antagonista foram purificados e caracterizados por técnicas físico química (SDS-PAGE, WB, HPLC, MS). Foram produzidos cerca de 1 mg de proteína de interesse para cada 10 mL de cultura, com pureza superior a 90% e com concentração da ordem de 0,1 mg/mL. No bioensaio, o tratamento com mGH apresentou aumento da massa corporal, similar ao hGH usado como controle, enquanto o G118R-mGH, na mesma dose, não apresentou crescimento. A pureza do radiomarcado foi acima de 90% e no estudo com SPECT-CT ocorreu dispersão por todo o corpo de ambas as proteínas e principalmente em várias regiões cerebrais. Conclusões: A produção e purificação do mGH e do G118R-mGH foram obtidas com êxito e os estudos com radiomarcação e dos estudos in vivo demonstraram uma diferença de atividade e biodistribuição, possivelmente relacionadas com diferenças nas ligações com o GHR, o que abre caminho para futuras pesquisas.